里氏木霉（T.reesei）
T.reesei 是一种无性繁殖的丝状真菌，它能够有效降解纤维素材料，并分泌一系列降解纤维素的酶。其中，外切葡聚糖和纤维二糖水解酶的产量最高，占其胞外分泌蛋白总量的60%以上。这一真菌已被长期用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类（王肖燕，2012）。T.reesei 具有优秀的真核蛋白修饰特性和蛋白分泌能力，适合作为基因工程宿主菌，生产外源蛋白，并进行了遗传改造，以便生产药用人源蛋白，例如进行 N-糖基化路径的人源化改造。龙昊等的研究完成了 T.reesei 的全基因组测序，对深入了解该工业菌株至关重要，并为鉴定其生长代谢相关的关键基因提供了有力平台。
Chritian 等（2013）分析了一株 T.reesei Rut-C30 突变菌株，其木聚糖酶的表达量极高，即使在无诱导物的情况下也表现如此。研究显示，这种突变株由于编码木聚糖酶的 Xyr1 基因的单位点突变，导致其内生木聚糖酶的表达量异常升高，伴随纤维素酶的表达量提升。然而，纤维素酶的含量在槐糖诱导下才有微小的提升。在所有分析条件下，cbh1 和 cbh2 的转录水平严格受限于 xyr1 的转录水平。此外，与野生型 QM6a 不同，突变体中 xyr1 与 cbh1/cbh2 在转录水平和槐糖诱导性上并无严格相关性，而在野生型中确实存在严格相关。
Kautto 等（2013）结合生物化学、转录组学和激光共聚焦方法，探讨了 T.reesei 中纤维二糖分解酶 I（CBHI）突变的细胞水平效应。通过荧光标记突变的 CBHI，构建了一个融合蛋白的亚细胞定位系统，并研究其与蛋白酶组的关联。突变的 CBHI 改变了 Rut-C30 的一些生理状态，影响了酶的分泌。研究还发现了一系列与 UPR 和 ERAD 相关的基因得到了正调控。MG132（N-苯酰碳酰（Cbz）-亮氨酸-亮氨酸-氨基酸酰肽）也抑制了蛋白酶的功能，这项研究首次揭示了丝核菌中蛋白酶对蛋白品质的调控作用。此外，激光共聚焦分析建议突变的 CBHI 在内质网（ER）中积累，并与蛋白酶共处。这表明在特定的分泌压力下，T.reesei Rut-C30 的高产蛋白是有一定的限制的。
当前，使用分子标签技术获得突变体已成为基因克隆和遗传分析的一种有效方法。建立 T.reesei 基因标签的插入突变体库是该领域功能基因组学发展的主要趋势（钟耀华等，2007）。Zhang 等（2011）开发了一个高效的 T-DNA 插入突变筛选系统，认为农杆菌介导的 T-DNA 转化为建立插入突变和研究基因功能提供有效手段，该系统同样需要高效的转化及筛选步骤。研究者采用绿色荧光蛋白（GFP）作为重要标记，并建立了 T.reesei 高效的 T-DNA 插入突变和筛选系统。利用便携式紧凑荧光显微镜，研究者在分生孢子、生长菌丝和菌丝中检测到强烈的 GFP 信号。研究也总结了通过 96 孔板和多标号计数记录荧光强度的快速筛选 T-DNA 标签突变体的方法，并进一步通过 Southern 杂交分析确定了基因组中 T-DNA 的插入状态。该研究利用 GFP 作为标记，建立了快速鉴定 T-DNA 插入突变和功能基因分析的方法体系。
在木霉研究中，菌株高效筛选标记的数目有限，难以实现多基因连续敲除。因此，建立丝状真菌选择标记删除系统，有助于多次遗传改造。尿嘧啶营养缺陷型标记具备高转化效率、易获得转化子的优点，研究中通常会将尿嘧啶营养缺陷型的互补基因 pyrG 转入相应缺陷型菌株进行补充，从而使受体菌表现出野生型生长。构建基因敲除载体时，会在标记基因臂上分别添加短的正向重复序列，以便切除转化子中的 pyrG 基因，随后在添加 5-氟乳清酸的培养基上进行筛选，便可得到不带标记基因的目的基因敲除菌株。该策略在多基因连续敲除中，实现了选择标记的重复利用，而未引入其他标记基因（王肖燕等，2012）。
在基因工程研究中，会影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度、启动子拷贝数、信号肽和蛋白质稳定性等。高效表达的内源基因可能对外源蛋白的产量造成影响。王肖燕等（2012）指出，T.reesei 表达外源蛋白时，cbh1、cbh2、eg1、eg2 等主要内源基因的相对高效表达必然影响外源基因的表达。他们在此基础上构建了 T.reesei 主要内源纤维素酶基因缺失菌株，旨在提升外源蛋白的表达量。通过重组 PCR 技术，他们分别构建了以 pyrG 为选择标记的 cbh1 和 cbh2 敲除盒，并添加短的正向重复序列，以保证筛选标记基因的重用。经基本培养基筛选获得基因单敲除菌株 Δcbh1：：pyrG+ 和 Δcbh2：：pyrG+。随后，利用 5-氟乳清酸对 Δcbh1：：pyrG+ 反筛，得到不带标记基因的 cbh1 基因敲除菌株 Δcbh1，无标记基因的 Δcbh2 进行进一步敲除，构建双基因敲除菌株 Δcbh1Δcbh2：：pyrG+，经过 5-氟乳清酸反筛去除标记基因获得双敲除菌株 Δcbh1Δcbh2。之后对 T.reesei 转化子进行了 PCR、Southern 验证和 PAGE 分析，结果表明基因缺失菌株的构建成功。菌株培养物上清液的 PAGE 电泳分析显示，cbh1 缺失菌株 Δcbh1 外切葡聚糖酶 I 的量明显下降，而外切葡聚糖酶 II 的分泌量有所提升；cbh2 缺失菌株 Δcbh2：：pyrG+ 外切葡聚糖酶 I 的量则与出发菌株无显著差异，但外切葡聚糖酶 II 的分泌量有下降趋势；而 cbh1/lcbh2 双缺失菌株 Δcbh1Δcbh2 外切葡聚糖酶 I 和外切葡聚糖酶 II 的量均明显下降。这项研究对 T.reesei Δtku70 菌株进行了目的性的分子生物学遗传改造，成功构建 cbh1 和 cbh2 基因的单敲除及双敲除菌株，提出的标记基因两侧各添加短重复序列以实现标记基因重复利用的策略为多基因的连续敲除提供了有效路径。
龙昊（2006）建立了以 pyrG 基因选择标记的 T.reesei 转化体系，研究者通过紫外线诱变技术获得了一株 T.reesei pyrG 基因缺陷菌株 M23。该菌株在不含尿苷核苷酸的培养基上无法生存，而转化了含有 pyrG 基因的质粒 pAB4-1 后即可正常生长。其转化率为每微克质粒200~300个转化子，这项研究构建的 pyrG 基因缺陷型菌株为后续 T.reesei 遗传转化系统奠定基础。
钟耀华等（2007）利用农杆菌 AGL1 成功转化 T.reesei QM9414。研究通过 T-DNA 随机插入 T.reesei 染色体，获得一批 T.reesei T-DNA 插入突变体，并得到潮霉素抗性的转化子，转化效率和稳定性都很高。序列分析表明 T-DNA 的随机插入，研究共获得经过分子验证的突变菌株200多株，并建立插入突变体库。进一步对突变子库进行表型筛选时，发现了七株形态异常的突变子。其中两个突变子的 T-DNA 插入位点位于同一基因不同条目，通过序列对比和系统分析，命名为 TrCCD1 基因。两个突变子和起始菌株的生长速度减缓，菌落较为松散；而在含0.2% TritonX-100 的培养基上则形成长的气生菌丝，造成菌落蓬松。此外，突变子的菌丝顶端与中间部位相比颜色明显变暗，且在 PDA 平板培养 4天后，只有中间部位产生绿色孢子，周边为白色菌丝，起始菌株的产孢面积明显较大。使用丙酮对培养基中的类胡萝卜素进行吸光度检测和高效液相色谱（HPLC）测定发现，突变菌株分泌的 β-胡萝卜素比起始菌株降低近一半，表明 TrCCD1 基因突变直接影响类胡萝卜素含量，同时在类胡萝卜素代谢中发挥重要作用。这一突变可能影响某种重要信号作用类胡萝卜素分子的生成，导致 T.reesei 菌丝生长和孢子发育异常，证明 TrCCD1 基因在生长发育中扮演重要调控角色。此外，其他五株突变子（PM2、PM48、HP7、HP13 和 HPL1）在形态上也有所不同，菌丝延伸速度较慢，有些菌落呈现明显辐射状，周围则有白色菌丝，无产孢迹象。PM2 菌丝顶部弯曲成团的现象尤为明显。通过 TAIL-PCR 扩增分析发现 PM48 的插入位于一个编码细胞周期相关蛋白的基因编码区，而 HPL1 的插入位点编码的蛋白可能与多聚腺苷酸结合相关，突变引起了其纤维素降解能力变化。
傅科鹤（2013）研究了在玉米生产过程中，T.reesei 对重金属及其他理化逆境因子的抵抗能力，从而对其生物防治效果产生影响。希望能通过突变体菌株创造耐受或吸附重金属的生防菌剂，进而对研究木霉菌剂与含重金属化学农药混用具有实际意义。该研究采用 ATMT 突变体系统构建方法，建立了1800余株突变体的突变体库，其中一株高吸附突变体 A01 在铜吸附特性上表现突出。当培养基内铜离子初始浓度为 0.7mM，初始 pH 值为 5.0 时，AT01 的铜吸附率达到了 96.1%，接近野生菌的两倍；同时，由于铜的吸附作用，AT01 的菌体颜色明显转为铜绿色，说明细胞内积累了大量铜离子。透射电镜观察表明，铜在细胞内积累主要位于液泡中。通过 Southern 印记
里氏木霉（T.reesei）
T.reesei是一种无性繁殖的丝状真菌，是重要的降解纤维素材料的丝状真菌之一，能够分泌一整套降解纤维素的酶系，其中外切葡聚糖和纤维二糖水解酶的产量最高，占胞外分泌蛋白总量的60%以上。T.reesei长期被用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类（王肖燕，2012）。该真菌具有典型的真核蛋白修饰特性和理想的蛋白分泌能力，已被作为基因工程宿主菌进行遗传改造，尤其是在生产药用人源蛋白的领域。龙昊等的研究完成了T.reesei全基因组测序，为深入了解该菌株提供了重大意义。
Chritian等（2013）分析的T.reesei Rut-C30突变菌株表现出非常高水平的木聚糖酶表达量，甚至在无诱导物添加的情况下。该突变是由于编码木聚糖酶的Xyr1基因的单位点突变，导致内生木聚糖酶表达量异常升高，同时伴随着纤维素酶表达量的提升。在所有分析条件下，cbh1和cbh2的转录水平受到xyr1转录水平的严格限制。
Kautto等（2013）的研究结合生物化学、转录组学和激光共聚焦方法，分析了T.reesei中纤维二糖分解酶Ⅰ（CBHI）突变所造成的细胞水平效应。突变的CBHI影响了Rut-C30的生理和酶的分泌，并导致与UPR和ERAD相关的多种基因的表达调控。这项研究首次报道了丝核菌中蛋白酶对蛋白品质的影响。
研究者利用分子标签技术建立了T.reesei基因标签的插入突变体库，这是该领域功能基因组学发展的趋势（钟耀华等，2007）。Zhang等（2011）开发了高效的T-DNA插入突变筛选系统，利用绿色荧光蛋白（GFP）作为标记进行突变与筛选。该研究建立了通过96孔板和多标号计数记录荧光强度的快速有效筛选T-DNA标签突变体的方法。
在木霉研究中，由于菌株高效筛选标记的数目有限，难以实现多基因连续敲除。因此，建立丝状真菌选择标记删除系统有利于进行多次遗传改造（王肖燕等，2012）。通过构建基因敲除载体并调整选择标记基因的重复利用，实现了多基因连续敲除。
在基因工程研究中，影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度、拷贝数、信号肽和蛋白稳定性等。王肖燕等（2012）利用重组PCR技术构建了以pyrG为选择标记的cbh1和cbh2敲除盒，并验证了目标基因敲除的成功。
龙昊（2006）建立了以pyrG基因为选择标记的T.reesei转化体系，并得到了实际的转化结果，为构建新的遗传转化系统奠定了基础。
钟耀华等（2007）利用农杆菌介导成功转化了T.reesei，建立了插入突变体库，并成功筛选出形态异常的突变体。这些突变菌株为研究功能和代谢提供了重要的基础。
傅科鹤（2013）构建了1800余株突变体库，发现具有显著铜吸附特性的突变体A01，其在处理重金属方面的应用前景广阔。
物理诱变方面，乐易林等（2004）通过紫外照射筛选高产木聚糖酶的突变菌株，进一步优化培养条件，提高了酶活力。
各种免疫细胞识别靶细胞的分子机制
γδT细胞的抗原识别机制
中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 述评
作者：何维
单位：中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院免疫室，北京 100005
T细胞表面表达两类抗原受体（TCR）：TCRαβ和TCRγδ。TCRαβ可特异地识别由抗原呈递细胞（APC）通过MHC分子呈递的抗原肽，而TCRγδ则主要以MHC非限制方式识别各类抗原。最近对TCRγδ识别抗原的类型和方式进行了深入研究，本文将对此进行总结。
1. TCRγδ的多样性和分布特点提示其抗原识别的特殊性。虽然γ、δ位点的V区多样性不及α和β，但其连接区多样性可以使TCRγδ表现出更大的变异。
2. γδT细胞的抗原识别类型与机制包括对MHC分子的识别以及非MHC分子的特征。人类外周血γδT细胞（Vδ9）能够识别同种异体树突形细胞表面的MHCⅡ类分子。
3. γδT细胞对非经典MHC类分子的识别意味着其识别机制并不单一，这可以通过不同最合适的抗原处理和呈递的方式来进行。
4. 最后，γδT细胞对热休克蛋白（hsp）的识别进一步揭示了其在免疫反应中的作用，其能迅速清除应激因素和受损细胞并启动后续免疫反应。
名词解释
注意是指心理活动对特定对象的指向和集中，常与感知觉、记忆、思维等心理过程相关联。选择性注意是注意加工刺激的倾向，同时忽视其他刺激。
小鼠种类汇总（持续完善中）
小鼠在生物医学研究中扮演着重要角色，其可帮助探索基因功能、疾病机制及药物筛选。其中，近交系小鼠和免疫缺陷小鼠常被用于实验。
